肠道病毒71
型(enterovirus71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，基因分型将其分为A,B和C三个基因型，其中B型和C型又可进一步分为B1一
BS和C1一CS'-'}oEV71感染常引起手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)}z}，主要发生在5岁以下儿童，少
数病例可并发脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎等，可导致死亡。自1997年以来，EV71在亚太地区流行[4-6]0自2008
年，该病在我国发生大流行，已成为我国现阶段重大的公共卫生问题之一。2009年，云南省共报告手足口病巧062例，其中重症302例，死亡13例，发病
率为33.1543/10万，死亡率为0.02886/10万。迄今，尚无治疗EV71感染患者的特效药物，疫苗是预防手足口病的最有效措施。
本研究对EV71的流行株进行分析，在Vero细胞上的适应性，以及病毒的抗原性和交叉保护试验进行研究，旨在能为疫苗的研制提供参考。
材料与方法
1.1标
本采集根据卫生部《手足口病预防控制指南(2009版)》的要求，所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县(区)为单位，每月最少需采集5例首次就诊的普
通病例标本;采自7省(其中包括昆明市、普洱市、楚雄州、曲靖市、红河州、临沧市、昭通市)临床诊断为手足口病患儿的2份疤疹液、7份咽拭子和1份粪便标
本采样患者均为轻症，结局为痊愈。确诊方法为RT-PCR，分离细胞为RD,HEP。
1.2标本的实验室检测EV71肠道病毒分离，RT-FCR试验方法均按卫生部《手足口病预防控制指南(2009版)》中《手足口病标本采集及检测技术方案》进行。
1.3VP1基因测序将8株病毒标本委托中国疾病预防控制中心进行测序，应用Mega软件对所得序列进行校正处理，与GenBank登陆序列进行比对，并构建基因亲缘性关系树。
1.4病毒滴度和抗原含量测定按照《手足口病预防控制指南(2009版)》和文献所述的方法分别进行病毒滴度和抗原含量 测定
1.5动物免疫将分离到的8株病毒接种于生长成单层的Ver。细胞上，病变达到75%以上进行收获。对收获液经560C30min灭活后，测定抗原含
量。用100U/剂(北京科兴生物制品有限公司标定)的收获液腹腔免疫ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，采用0d,14d2针免疫。
第0d,14d,28d采血。4℃条件下离心，获得血清。
1.6中
和试验采用微量板细胞病变法检测中和抗体效价〔7.RJ。血清样本按2倍系列稀释法进行稀释，56℃水浴灭活30min。血清稀释后分别与
100CCID5。病毒等体积混合，于96孔板中置37qCC0,培养箱中中和2h，加人Ver。细胞悬液，细胞浓度为2x105个/ml。置
37cCCOZ培养箱中培养7d,显微镜下观察细胞病变，以能抑制50%细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和效价。试验设立细胞对照、血清对照和病毒对照，同时设立回滴(回滴结果在32一320CCIDSO/0.05ml时，试验成立)。检测结果以1:8判断为中和抗体阳性。
1.7交叉保护试验将8个病毒株免疫后血清分别与A基因型、B3基因型,C4基因型病毒进行中和试验。将C4基因型毒株免疫血清分别对8个病毒株进行中和试验，C4基因型病毒来自北京科兴生物制品有限公司。
2结果
2.1检测结果实验室通过RT-PCR检测，8份标本结果均为EV71。使用Ver。细胞培养中引起特殊肠道病毒致细胞病变效应，表现为细胞圆缩、分散、胞质内颗粒增加，最后细胞自瓶壁脱落。8份标本在Ver。细胞中产生明显病变，对其进行后续试验。
2.2基
因测序病毒滴度:8株病毒在Ver。细胞中均可有效增值，但增值水平略有不同。除1株(299")小于5.OLgCCIDSO/ml以外，其他7株
均>5.SSLgCCIDSO/ml。抗原含量:8株病毒经Vero细胞传代后均能监测到抗原，抗原含量均能达到100U/ml以上。